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日前，ECHA向注冊者發(fā)布了關(guān)于在評估化學(xué)品的皮膚致敏性時如何可靠地結(jié)合不同來源的替代數(shù)據(jù)的建議。該建議是基于經(jīng)合組織（OECD）的一份名為《Guideline on Defined Approaches for Skin Sensitisation》的新指南，由OECD皮膚致敏性判定方法專家組（OECD Expert Group on Defined Approaches for Skin Sensitisation；EG DASS）制定完成。該指南包含評估一種物質(zhì)是否為皮膚致敏劑的明確方法，并對致敏性強弱進行分類。

這種分類非常重要，因為REACH要求評估皮膚致敏的效力。如果采用這種判定方法（defined approaches，DAs）在皮膚致敏性和效力方面得出結(jié)論，將可以取代目前常用的體內(nèi)淋巴結(jié)試驗（LLNA），從而減少對動物的測試。

皮膚致敏劑（skin sensitiser）是一類皮膚重復(fù)接觸后產(chǎn)生皮膚致敏反應(yīng)的物質(zhì)。皮膚致敏反應(yīng)一般是由于致敏物與體內(nèi)蛋白質(zhì)的共價結(jié)合。它是一個由分子啟動并產(chǎn)生系列關(guān)鍵事件（key events, KEs），最終造成過敏性皮炎的作用過程。分子啟動是第一個關(guān)鍵事件（KE1），由皮膚蛋白質(zhì)中親電物質(zhì)與親核中心的共價結(jié)合開始，即蛋白結(jié)合（protein binding）。第二個關(guān)鍵事件（KE2）發(fā)生在角質(zhì)形成細胞中，包括炎癥反應(yīng)以及與特定細胞信號通路（如抗氧化/電泳反應(yīng)元件（ARE）依賴通路）相關(guān)的基因表達變化，即角化細胞活化（keratinocyte activation）。第三個關(guān)鍵事件（KE3）是樹突狀細胞的激活（dendritic cell activation），通常通過特定細胞表面標志物、趨化因子和細胞因子的表達來評估。第四個關(guān)鍵事件（KE4）是T細胞增殖，最終造成過敏性接觸性皮炎。

根據(jù)該指南，致敏性判定的方法（DA）為使用一組定義的信息源生成一個固定的數(shù)據(jù)解釋程序（DIP）（如數(shù)學(xué)模型、基于規(guī)則的方法）并應(yīng)用于目標物質(zhì)，以得出預(yù)測，而無需專家判斷。致敏性判斷的信息源（數(shù)據(jù)）一般來自體外化學(xué)分析法(in chemico)、體外試驗（in vitro）和計算機模擬評價(in silico)等。多個信息源的數(shù)據(jù)可以在DAs中一起使用以獲得與動物試驗相同或更好的預(yù)測能力，從而預(yù)測人類的反應(yīng)。DAs的方法組合可以克服個別獨立方法的一些局限性，以提高對獲得的總體結(jié)果的可信度。

在使用DA之前，測試實驗室應(yīng)考慮所有有關(guān)測試化學(xué)品的相關(guān)信息，如測試化學(xué)品的識別特征（CAS，SMILES等）、化學(xué)結(jié)構(gòu)、物理化學(xué)性質(zhì)、毒理學(xué)數(shù)據(jù)（如果可用）等，以確定該特定DA是否適用于試驗化學(xué)品。

該DAs中包含196種化學(xué)品的綜合數(shù)據(jù)集，包括DA預(yù)測數(shù)據(jù)、個人信息源數(shù)據(jù)、高度精確的LLNA和人類斑貼預(yù)測試驗（HPPT）數(shù)據(jù)以及理化性質(zhì)數(shù)據(jù)。這些化學(xué)品中，168種具有LLNA分類，66種化學(xué)品具有HPPT分類，這些分類均經(jīng)EG DASS認可，并用于評估DAs的性能。該數(shù)據(jù)集主要包含化妝品成分，但也包含跨領(lǐng)域使用的其他類型的化學(xué)品，如防腐劑、染料或食品成分。數(shù)據(jù)集的化學(xué)成分多種多樣，如這些化學(xué)品所涵蓋的物理化學(xué)性質(zhì)所示：它包含小分子和大分子（分子量范圍為30至512 g/mol）、疏水性和親水性物質(zhì)（對數(shù)P范圍為-3.9至9.4）、固體和液體（熔點范圍為-122至253oC）、揮發(fā)性和非揮發(fā)性物質(zhì)（沸點范圍為-19至445oC）等。

▌該指南中推薦的DAs目前共有以下三種：

◆“三取二”（2o3）策略
用于評估皮膚致敏性危害（分陰性、陽性）。該策略包含OECD正式描述的導(dǎo)致皮膚過敏KEs前三個中的至少兩個。KE1：蛋白質(zhì)結(jié)合（直接肽反應(yīng)性分析（direct peptide reactivity assay，DPRA））；KE2：角化細胞活化（KeratinoSens?）；KE3：樹突狀細胞激活（人類細胞系激活試驗（human cell line activation test，h-CLAT））。2o3 DA中的數(shù)據(jù)解釋程序（data interpretation procedure，DIP）是一種透明、基于規(guī)則的方法，無需專家判斷。該策略通過KE1-3相關(guān)的三種國際公認的非動物分析方法（即DPRA、KeratinoSens?、h-CLAT），以未定義的順序進行連續(xù)測試，預(yù)測皮膚過敏風(fēng)險。對兩個KEs進行分析，如果這些分析的結(jié)果一致，則相應(yīng)地預(yù)測化學(xué)品為陰性或陽性。如果前兩次分析結(jié)果不一致，則運行剩余KE的分析。

◆ 基于UN GHS效力分類的綜合測試策略（Integrated Testing Strategy，ITSv1）
用于評估皮膚致敏性危害和效力（分GHS 1A、1B和NC，即強致敏性、中等到弱致敏性、無分類）。該策略包括導(dǎo)致皮膚過敏KEs中的KE1和KE3，并包括對皮膚致敏性的計算模擬預(yù)測（in silico）。使用DPRA定量評估蛋白質(zhì)結(jié)合（KE1），按致敏性強弱評0-3分；h-CLAT定量評估樹突狀細胞激活（KE3），按致敏性強弱評0-3分；(Q)SAR軟件Derek Nexus（ITSv1）提供了對皮膚敏感性的計算模擬預(yù)測，按有無致敏性評0-1分。DPRA或h-CLAT其中一種方法可用時，既可進行評估，三種方法均可用時，評估結(jié)果最為可靠確切。具體分類方法如下：

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◆ 基于ITSv1修改后的策略（ITSv2）
用于評估皮膚致敏性危害和效力（分GHS 1A、1B和NC，即強致敏性、中等到弱致敏性、無分類）。該方法將ITSv1中計算模擬預(yù)測方法由Derek Nexus軟件變更為OECD QSAR Toolbox。評估執(zhí)行策略與ITSv1基本一致。

▌三種方法的部分預(yù)測性能數(shù)據(jù)如下：

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注：敏感性（sensitivity, Sens)）表示真陽性率，特異性（specificity, Spec）為真陰性率，平衡準確度（balanced accuracy, BA）為敏感性和特異性的平均值。由于參考數(shù)據(jù)的不平衡性，同一方法的不同分類結(jié)果存在差異。

這三種DAs均具有較高的準確度，在具體使用過程中，還可通過結(jié)合實際物質(zhì)情況選擇合適方法及策略以達到更高的預(yù)測準確度。其中，有些DAs并不適用于金屬、無機化合物、UVCB和混合物等物質(zhì)。另外，在采用LLNA數(shù)據(jù)運行DPRA 、KeratinoSens?、h-CLAT等DAs預(yù)測Log P > 3.5類物質(zhì)時靈敏度比較低，而且采用LLNA數(shù)據(jù)相比HPPT數(shù)據(jù)更容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果，即目前的參考物質(zhì)數(shù)量不足以對Log P > 3.5的物質(zhì)得出確定度高的結(jié)論。

此外，在臨界判斷范圍附近的單個分析結(jié)果可能會產(chǎn)生不確定的DA預(yù)測（低置信度），該指南對每種DA的臨界判斷范圍進行了說明。如DPRA方法的結(jié)果臨界范圍為4.95% - 8.32%，當肽鏈消耗小于4.95%時則可初步判定為陰性，大于8.32%則為陽性。為了避免臨界范圍導(dǎo)致的錯誤判斷，KeratinoSens?、h-CLAT兩種方法均需要多次運行。在DPRA方法中，當肽鏈消耗在3-10%（僅使用半胱氨酸時則為9%-17%）之間時也要多次運行以得到確切結(jié)果。例如初次運行結(jié)果為3%~4.95%，則進行第二次運行，兩次結(jié)果為陰性則最終結(jié)果為陰性，如果兩次不一致則運行第三次，取其中兩次相同的結(jié)果作為最終結(jié)果（陰性、陽性或臨界值（Borderline））。

對于最終危害/效應(yīng)分類，具有高置信度的DA預(yù)測被認為是決定性的，低置信度的DA預(yù)測則是非決定性的（Inconclusive）。例如Log P>3.5的化學(xué)品獲得的陰性h-CLAT結(jié)果具有較低的置信度，可能會導(dǎo)致不確定的2o3 DA預(yù)測。該指南也專門對不同的DA置信度結(jié)果進行了最終危害/效應(yīng)分類說明。

策略ITSv1和ITSv2分別用到了QSAR預(yù)測工具Derek Nexus和OECD QSAR Toolbox，只有在DPRA和h-CLAT中至少一種方法可用的情況下才有使用QSAR預(yù)測的必要，否則這兩種DAs均不可使用。指南中也對兩種QSAR預(yù)測工具的使用方法和應(yīng)用范圍進行了說明。

總的來說，OECD的這個皮膚致敏性判定指南將多種方法原理進行結(jié)合用于未知物質(zhì)的皮膚致敏性判斷，即保證了準確率，操作難度也不高，可以在不進行動物試驗的情況下很好的解決致敏性判定的問題，符合人道主義精神的同時還能節(jié)省試驗周期。ECHA目前已經(jīng)認可該方法并建議注冊單位積極采用該方法獲取數(shù)據(jù)。相關(guān)REACH注冊企業(yè)也可以積極響應(yīng)起來，將該方法應(yīng)用到實際產(chǎn)品的注冊中。